pan-KRAS (KD = 6.9, 4.5, 32, 26, 4.3 nM for WT, G12C, G12D, G12V and G13D mutant KRAS, respectively)
BI-2865 targets KRAS, a small GTPase that is the most frequently mutated oncogene in human cancers. It binds to a broad range of KRAS mutants, including G12C, G12D, G12V, and G13D, as well as wild-type KRAS. By binding to the inactive GDP-bound state, it prevents the activation of KRAS and downstream signaling through the MAPK pathway. This non-covalent mechanism is distinct from covalent inhibitors that target the mutant cysteine of G12C.

BI-2865 是一种标记的端口氨基醇取代基和末端销连接等效物。BI-2865 的 E62 和 R68 侧链（5 天）与 BI-2865 有直接的离子键，这已通过 BI-2865 与 KRAS 结合的共晶结构得到证实。当 IL-13 存在时，G12C、G12D 或 G12V 的表达受到抑制。在 BaF3 细胞生长过程中，突变型 KRAS 的平均 IC50 和 Q61 主链位置形成水介导的氢键网络 [1]。浓度约为 140 nM。体外实验表明，BI-2865 对多种 KRAS 变体具有很强的结合亲和力。该化合物对KRAS野生型、G12C、G12D、G12V和G13D的Kd值分别为6.9 nM、4.5 nM、32 nM、26 nM和4.3 nM。在细胞实验中，该化合物能抑制表达KRAS G12C、G12D或G12V突变体的BaF3细胞增殖，平均IC50值约为140 nM。这表明该化合物对多种KRAS突变体均具有抗增殖活性。

BI-2865 提高了紫杉醇在 P-gp 过表达异种移植瘤中的体内疗效[2]
为了进一步验证 BI-2865 在体内抑制多药耐药性 (MDR) 的能力，我们将已建立的 P-gp 过表达 KBv200 细胞皮下移植到 3 周龄雌性 BALB/c 裸鼠体内。当肿瘤体积接近 100 mm³ 时，我们将小鼠随机分为四组，并每两天给予指定剂量的药物。结果显示，单独使用生理盐水、15 mg/kg 紫杉醇或 30 mg/kg BI-2865 治疗的小鼠，其肿瘤生长情况无统计学差异；而紫杉醇与 BI-2865 联合用药则显著抑制了肿瘤体积和重量的增长，且未影响小鼠的体重增加（图 2A-D）。总的来说，这些结果证实，BI-2865 能显著增强 P-gp 过表达介导的 MDR 异种移植瘤中紫杉醇的治疗效果。研究人员发现，BI-2865 显著增强了 P-gp 驱动的 MDR 癌细胞对包括紫杉醇、长春新碱和阿霉素在内的化疗药物的反应，而这种效应在亲代敏感细胞以及 BCRP 或 MRP1 驱动的 MDR 细胞中未观察到。重要的是，小鼠体内联合用药研究证实，BI-2865 能有效增强紫杉醇的抗肿瘤作用，且无毒性损伤。其机制在于，BI-2865 通过直接阻断 P-gp 的外排功能，促进阿霉素在癌细胞中的积累；更具体地说，这是通过 BI-2865 与 P-gp 的药物结合位点竞争性结合实现的。此外，在有效的MDR逆转浓度下，BI-2865既不改变P-gp的表达和定位，也不降低其下游AKT或ERK1/2信号通路活性。
结论：本研究揭示了BI-2865作为MDR调节剂的新应用，该调节剂可能用于有效、安全且特异性地提高临床P-gp介导的MDR难治性癌症的化疗疗效。[2]

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在体内，BI-2865被用作研究工具，用于研究泛KRAS抑制剂在动物模型中的作用。其阻断KRAS驱动信号通路的能力使其成为研究靶向KRAS治疗各种癌症潜力的宝贵化合物。具体的体内疗效数据可在临床前研究文献中找到。

RAS 激活分析[1]
使用活性 Ras pull-down 和检测试剂盒检测 RAS 活性。简而言之，将 GST-RAF1 RBD 和谷胱甘肽琼脂糖树脂与全细胞裂解液混合，并在 4 °C 下于旋转器上孵育 1 小时，然后用 2× SDS-PAGE 上样缓冲液洗涤三次并洗脱。之后，使用 KRAS 特异性抗体（2F2，Sigma）通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析样品。当外源表达表位标记的 KRAS、NRAS 和/或 HRAS 变体时，表位特异性抗体能够特异性地检测这些变体的 GTP 结合构象。

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ITC[1]
在 MicroCal PEAQ-ITC 仪器上进行泛 KRASi（BI-2865）的量热实验。蛋白质溶液经透析置换至含有 20 mM HEPES（pH 7.6）、130 mM 氯化钠、2 mM 氯化镁和 0.5 mM TCEP 的缓冲液中。所有测量均在 23 °C 下进行。待测物和滴定剂的浓度均调整至 3% DMSO。样品池中加载浓度范围为 0 至 40 μM 的蛋白质溶液。所有进样均采用先进样 0.5 μl，再进样 19 次，每次进样 2 μl，化合物浓度范围为 100–500 μM。数据采用 MicroCal PEAQ-ITC 分析软件（v.1.1.0.1262）进行分析。第一个数据点被排除在分析之外。热力学参数通过以下公式计算：ΔG = ΔH − TΔS = −RTlnKd，其中 ΔG、ΔH 和 ΔS 分别为结合的自由能、焓和熵的变化，T 为温度，R 为通用气体常数（补充图 2）。

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表面等离子体共振[1]
表面等离子体共振实验在 Biacore 8K 仪器上进行。链霉亲和素在 25 °C 下用 10 mM HBS-P+ 缓冲液（pH 7.4）固定在 CM5 芯片上。使用 400 mM 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和 100 mM N-羟基琥珀酰亚胺活化表面（接触时间 420 s，流速 10 ml min−1）。将链霉亲和素稀释至终浓度为 1 mg ml⁻¹，溶于 10 mM 乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中，并注入 600 秒。随后，注入 1 M 乙醇胺溶液 420 秒以钝化表面，并用 50 mM NaOH 和 1 M NaCl 溶液进行表面活化。生物素化靶蛋白的稀释和链霉亲和素偶联均使用不含 DMSO 的运行缓冲液进行。靶蛋白的浓度为 0.1 mg ml⁻¹，偶联密度为 200 至 800 个响应单位。所有相互作用实验均在 25 °C 下进行，所用缓冲液为：20 mM Tris(羟甲基)氨基甲烷、150 mM 氯化钾、2 mM 氯化镁、2 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐、0.005% Tween20、40 μM 鸟苷 5′-二磷酸，pH 8.0，1% DMSO。化合物用缓冲液稀释后注入固定化的靶蛋白表面（KRAS 突变体的浓度范围为 6.25–1,000 nM）。使用 Biacore Insight 软件进行数据分析前，从原始数据中减去参考表面和空白注射的传感图。采用包含质量传递项的 1/1 相互作用模型测定亲和力和结合动力学参数。

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P-gp ATPase 活性测定[2]
P-gp ATPase 活性通过比色法测定进行评估，具体方法如前所述。从过表达 P-gp 的 High Five 昆虫细胞中分离粗膜。将粗膜蛋白（100 µg 蛋白/mL）与不同剂量的 BI-2865（0–5 µM）在 pH 6.8 的缓冲液（由 50 mM KCl、2 mM EDTA、10 mM MgCl2、1 mM DTT 和 5 mM 叠氮化钠组成）中于 37 °C 孵育 5 分钟，孵育过程中加入或不加入 0.3 mM 原钒酸钠 (Na3VO4)。然后加入Mg-ATP溶液（5 mM）以启动ATP水解，并在37 °C下反应20分钟。之后，加入30 µL 10% SDS溶液终止反应。随后加入检测试剂（含10%抗坏血酸、15 mM乙酸锌和35 mM钼酸铵），在37 °C下再次孵育20分钟，然后使用96孔Fisher Scientific Multiskan FC微孔板读数仪在750 nm处测量混合物的吸光度。根据标准曲线定量无机磷酸盐的释放量。最终，BI-2865刺激的P-gp ATPase活化定义为在有无Na3VO4存在下ATP释放的无机磷酸盐量的变化。

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BI-2865与KRAS的结合通过生化分析进行评估，例如表面等离子共振(SPR)或等温滴定量热法(ITC)，并测定其Kd值。其抑制核苷酸交换和阻止KRAS活化的能力可通过核苷酸交换分析进行测定。细胞活性通过使用KRAS突变细胞系的增殖分析进行评估。

细胞活力检测和细胞增殖检测[1]
单个癌细胞系[1]
将细胞以每孔2000个细胞的密度接种于96孔板中，至少设置三个复孔，并用指定浓度的BI-2865处理。72小时后，使用CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。从原始数据中减去背景值（不含细胞的培养基），并计算相对于零时点的倍数变化。

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同源BaF3细胞[1]
简而言之，用源自表达KRAS G12C、G12D或G12V突变体的质粒（pMSCV-KRAS-PGK-Puro-IRES-GFP）的病毒转导BaF3细胞。通过荧光激活细胞分选（FACS）监测转导效率。细胞在嘌呤霉素 (1 µg ml−1) 和 IL-3 (10 ng ml−1) 的培养基中筛选 1-2 周，或直至对照细胞死亡。随后撤除 IL-3，并在无 IL-3 的条件下进行数代传代培养。通过测序确认外源 KRAS 的整合。为确定药物处理对细胞增殖的影响，将 1500 个细胞接种于 384 孔板中，每孔加入 60 µl 含 10% FCS 的 Roswell Park Memorial Institute 培养基，并在 37 °C 下培养过夜。细胞活力测定方法同上。

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274 个细胞系的高通量筛选[1]
简而言之，将细胞以各细胞系规定的密度接种于黑色 384 孔组织培养板中，每孔加入 25 μl 生长培养基，并在处理前于 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时。在处理时，收集一组未接受处理的检测板，并使用 CellTiter-Glo v.2.0 和 Envision 酶标仪测定 ATP 浓度。使用 Echo 声波液体处理系统将 BI-2493（BI-2865 的结构类似物）转移至检测板。将检测板与化合物孵育 5 天，然后使用 CellTiter-Glo 进行分析。所有数据点均通过自动化流程采集，并经过质量控制，然后使用 Horizon 的专有软件进行分析。Horizon 使用生长抑制作为细胞生长的指标。生长抑制率的计算方法如下：若 T < V0，则 100 (1 − (T − V0)/V0)；若 T ≥ V0，则 100 (1 − (T − V0)/(V − V0))。其中，T 为受试物的信号测量值，V 为未处理或载体处理的对照组测量值，V0 为零时刻（通常称为 T0 板）未处理或载体处理的对照组测量值。该公式源自美国国家癌症研究所 (NCI) NCI-60 高通量筛选中使用的生长抑制 (GI) 计算方法。

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在携带不同 KRAS 突变的癌细胞系中评估 BI-2865 的细胞活性。用 BI-2865 处理细胞，并测量其对细胞增殖的影响。通过蛋白质印迹法评估其对 KRAS 信号通路（例如 ERK 磷酸化）的影响，以确认靶点结合情况。

用于体内研究的抑制剂是结构与BI-2865相似的类似物（BI-2493），剂量为90 mg/kg，每日两次。采用灌胃法给药，给药量为10 ml/kg。由一名不知晓研究目的的研究技术人员使用游标卡尺以非盲法测量对照组和治疗组的平均肿瘤直径（测量肿瘤的两个垂直轴）。数据分析采用Prism（GraphPad Software）软件进行。本文所述的泛KRAS抑制剂（GDP-KRAS抑制剂）可通过勃林格殷格翰的开放创新门户网站opnMe.com参与合作项目：https://opnme.com/collaborate-now/GDP-KRAS-inhibitor-bi-2493。[1]

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采用MTT法检测了BI-2865的体外细胞毒性及其多药耐药（MDR）清除效果，并通过P-gp介导的KBv200小鼠异种移植模型评估了其体内相应的逆转作用。采用荧光标记的阿霉素流式细胞术实验评估了BI-2865诱导的细胞药物释放和储存的变化，并通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析了异种移植瘤中化疗药物的积累情况。通过钒酸盐敏感的ATPase活性测定、[125I]-IAAP光标记测定和计算机分子对接分析了BI-2865抑制P-gp底物外排的机制。采用Western blotting、流式细胞术和/或qRT-PCR检测了BI-2865对P-gp表达和KRAS下游信号通路的影响。通过免疫荧光法观察了P-gp的亚细胞定位。[2]在动物实验中，BI-2865通常通过灌胃或腹腔注射给药于啮齿动物。在KRAS突变型癌症的小鼠异种移植模型中，给予BI-2865以评估其对肿瘤生长的影响。通过检测肿瘤组织中ERK磷酸化等药效学标志物来验证信号通路调控。

BI-2865 是一种小分子（分子量 465.57，C23H27N7O2S）。它可溶于二甲基亚砜 (DMSO) 和乙醇。其非共价结合机制是其药理学特性的关键特征。临床前研究已提供了详细的药代动力学性质，例如半衰期和生物利用度。

BI-2865的毒理学数据有限。作为一种泛KRAS抑制剂，其对含有野生型KRAS的正常组织的潜在影响值得考虑。然而，在研究模型中的应用表明，在疗效研究中使用的剂量下，该药物具有良好的耐受性。

[1]. Pan-KRAS inhibitor disables oncogenic signalling and tumour growth. Nature. 2023 Jul;619(7968):160-166.

[2]. BI-2865, a pan-KRAS inhibitor, reverses the P-glycoprotein induced multidrug resistance in vitro and in vivo. Cell Commun Signal. 2024 Jun 13;22(1):325

KRAS是癌症中最常见的突变蛋白之一，其功能几十年来一直备受争议。目前最成功的策略之一是开发共价等位基因特异性抑制剂，该抑制剂能够捕获处于非活性构象的KRAS G12C，从而抑制患者肿瘤的生长。^1-7 选择性抑制非活性状态是否可用于治疗非G12C KRAS突变体仍有待研究。本文报道了一种非共价抑制剂的发现和表征，该抑制剂能够优先且高亲和力地结合KRAS的非活性状态，而不影响NRAS和HRAS。尽管RAS亚型GTPase结构域的氨基酸残基数量有限，但其进化差异足以赋予KRAS选择性的正构和变构限制。该抑制剂阻断核苷酸交换，从而抑制野生型KRAS和多种KRAS突变体（包括G12A/C/D/F/V/S、G13C/D、V14I、L19F、Q22K、D33E、Q61H、K117N和A146V/T）的激活。下游信号传导和增殖的抑制仅限于携带突变型KRAS的癌细胞，并且该药物治疗可抑制小鼠体内KRAS突变肿瘤的生长，而不会对动物的体重产生不利影响。我们的研究表明，大多数KRAS癌蛋白在癌细胞中于活性和非活性状态之间循环，并且它们的激活依赖于核苷酸交换。泛KRAS抑制剂（例如本文所述的抑制剂）具有广泛的治疗意义，值得在KRAS驱动型癌症患者中进行临床研究。[1]

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背景：多药耐药性（MDR）限制了癌症化疗的成功率。 P-糖蛋白（P-gp）、BCRP和MRP1是多药耐药（MDR）的关键触发因子。遗憾的是，目前尚无MDR调节剂获得FDA批准。本研究旨在探讨泛KRAS抑制剂BI-2865在体外和体内逆转P-gp、BCRP和MRP1诱导的MDR的作用及其机制。方法：采用MTT法检测BI-2865的细胞毒性和体外MDR清除效果，并利用P-gp介导的小鼠KBv200异种移植瘤模型评估其相应的体内逆转效果。采用荧光标记阿霉素的流式细胞术评估BI-2865对细胞内药物释放和储存的影响，并采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析化疗药物在异种移植瘤中的积累情况。本研究采用钒酸盐敏感型ATPase活性测定、[125I]-IAAP光标记测定和计算机分子对接分析了BI-2865抑制P-gp底物外排的机制。利用Western blotting、流式细胞术和/或qRT-PCR检测了BI-2865对P-gp表达及KRAS下游信号通路的影响。采用免疫荧光法观察了P-gp的亚细胞定位。结果表明，BI-2865显著增强了P-gp驱动的多药耐药（MDR）癌细胞对包括紫杉醇、长春新碱和阿霉素在内的化疗药物的反应，而这种增强作用在亲代敏感细胞或BCRP或MRP1驱动的MDR细胞中未观察到。重要的是，小鼠体内联合治疗研究证实，BI-2865能有效增强紫杉醇的抗肿瘤作用，且无毒副作用。从机制上讲，BI-2865 通过直接阻断 P-gp 的外排功能来促进阿霉素在癌细胞中的积累。更具体地说，BI-2865 通过与 P-gp 的药物结合位点竞争性结合来实现这一目标。此外，在有效的 MDR 逆转浓度下，BI-2865 既不改变 P-gp 的表达和定位，也不降低其下游 AKT 或 ERK1/2 信号通路的活性。
结论：本研究揭示了 BI-2865 作为 MDR 调节剂的新应用，可用于有效、安全、特异性地提高临床上 P-gp 介导的 MDR 耐药癌症的化疗疗效。[2]

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BI-2865（CAS：2937327-93-8）是一种突破性的研究工具，证明了非共价泛 KRAS 抑制的可行性。该化合物能够高亲和力地结合多种KRAS突变体，包括缺乏半胱氨酸残基的G12D突变体（该残基可用于共价靶向），这代表了KRAS药物研发领域的一项重大进展。它是研究泛KRAS抑制以及开发下一代KRAS靶向疗法的关键化合物。

C23H27N7O2S

465.571182489395

465.19

C, 59.34; H, 5.85; N, 21.06; O, 6.87; S, 6.89

2937327-93-8

2937327-93-8

168268166

Light yellow to brown solid

1.38±0.1 g/cm3(Temp: 20 °C; Press: 760 Torr)(Predicted)

708.7±70.0 °C(Predicted)

4.1

155

1

10

5

33

752

3

C12CCC[C@](C)(C3ON=C(C4=NC=CC(O[C@H]([C@@H]5CCCN5C)C)=N4)N=3)C=1C(C#N)=C(N)S2

MIUFORKWYHBPRW-HMFCALDFSA-N

InChI=1S/C23H27N7O2S/c1-13(15-6-5-11-30(15)3)31-17-8-10-26-20(27-17)21-28-22(32-29-21)23(2)9-4-7-16-18(23)14(12-24)19(25)33-16/h8,10,13,15H,4-7,9,11,25H2,1-3H3/t13-,15-,23-/m0/s1

(4S)-2-amino-4-methyl-4-[3-[4-[(1S)-1-[(2S)-1-methylpyrrolidin-2-yl]ethoxy]pyrimidin-2-yl]-1,2,4-oxadiazol-5-yl]-6,7-dihydro-5H-1-benzothiophene-3-carbonitrile

BI-2865; BI2865; BI-2865; 2937327-93-8; SCHEMBL26167321; BI 2865

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~250 mg/mL (536.98 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。